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革兰氏染色原理  

2008-05-22 11:43:38|  分类: 【 Major 】 |  标签: |举报 |字号 订阅

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国内经典解释:

     革兰氏染色法是1884年由丹麦病理学家Christain Gram氏创立的,革兰氏染色法可将所有的细菌区分为革兰氏阳性菌(G+)和革兰氏阴性菌(G-)两大类。

革兰氏染色法是细菌学中最重要的鉴别染色法。革兰氏染色法所以能将细菌分为革兰氏阳性和革兰氏阴性,是由这两类细菌细胞壁的结构和组成不同决定的。实际上,当用结晶紫初染后,像简单染色法一样,所有细菌都被染成初染剂的蓝紫色。作为媒染剂,它能与结晶紫结合成结晶紫一碘的复合物,从而增强了染料与细菌的结合力。当用脱色剂处理时,两类细菌的脱色效果是不同的。革兰氏阳性细菌的细胞壁主要由肽聚糖形成的网状结构组成,壁厚、类脂质含量低,用乙醇(或丙酮)脱色时细胞壁脱水、使肽聚糖层的网状结构孔径缩小,透性降低,从而使结晶紫-碘的复合物不易被洗脱而保留在细胞内,经脱色和复染后仍保留初染剂的蓝紫色。革兰氏阴性菌则不同,由于其细胞壁肽聚糖层较薄、类脂含量高,所以当脱色处理时,类脂质被乙醇(或丙酮)溶解,细胞壁透性增大,使结晶紫-碘的复合物比较容易被洗脱出来,用复染剂复染后,细胞被染上复染剂的红色。

国外教科书的解释

Gram+ bacteria have a cell wall surrounding the plasma membrane, and the stain reacts directly with components of the wall.

Gram- bacteria have a second membrane surrounding the cell wall. The presence of the membrane, and differences in the constitution of the wall, prevent the stain from reacting.

乍看下解释完全不同,但了解后,两者并不矛盾。

参 考 资 料

细菌细胞壁(Cell wall)

        1:细胞壁为细菌表面比较复杂的结构。是一层较厚(5~80nm)、质量均匀的网状结构,可承受细胞内强大的渗透压而不破坏。细胞壁坚韧而有弹性。

        2: 细胞壁主要组份:

         细胞壁主要成分是肽聚糖(Peptidoglycan),又称粘肽(Mucopetide)。细胞壁的机械强度有赖于肽聚糖的存在。合成肽聚糖是原核生物特有的能力。肽聚糖是由N-乙酰葡萄糖胺和N-乙酰胞酸两种氨基糖经β-1.4糖苷键连接间隔排列形成的多糖支架。在N-乙酰胞壁酸分子上连接四肽侧链,肽链之间再由肽桥或肽链联系起来,组成一个机械性很强的网状结构。各种细菌细胞壁的肽聚糖支架均相同,在四肽侧链的组成及其连接方式随菌种而异。

         革兰氏阳性菌例如葡萄球的四肽侧链氨基酸由D-丙-D-谷-r-L-赖-D-丙组成。初合成的肽链末端多一个D-丙氨酸残基。肽桥是一条5个甘氨酸的肽链,交联时一端与侧链第三位上赖氨酸连接,另一端在转肽酶的作用下,使另一条五肽侧链末端D-丙氨酸脱去,而与侧链第四位D-丙氨酸连接。从X光检查可见肽聚糖的多糖链是一条较硬而又呈螺旋状卷曲的长杆,由于其呈螺旋状,连接在其上的肽链才伸向四方,使交联受到一定了限制,只有邻近的肽链才可交联。但葡萄球菌的肽桥较长,有可塑性,使远距离的肽链间也可交联,交联率达90%,形成坚固致密的三维立本网状结构。而革兰氏阴性大肠杆菌的四肽侧链中第三位的氨基酸被二氨基庚二酸(DAP)所取代,以肽链直接与相邻四肽侧链中的D-丙氨酸相连,且交联率低,没有五肽交联桥,形成二维平面结构,所以其结构较革兰氏阳性的葡萄球疏桦。

         凡能破坏肽聚糖结构或抑制其合成的物质,都能损伤细胞壁而使细菌变形或杀伤细菌,例如溶菌酶(Lysozyme)能切断肽聚糖中N-乙酰葡萄糖胺和N-乙酰胞壁酸之间的β-1.4糖苷键之间的联苷键之间的联结,破坏肽聚糖支架,引起细菌裂解。青霉素和头孢菌素能与细菌竞争合成胞壁过程所需的转肽酶,抑制四肽侧链上D-丙氨酸与五肽桥之间的联结,使细菌不能合成完整的细胞壁,可导致细菌死亡。人和动物细胞无细胞壁结构,亦无肽聚糖,故溶菌酶和青霉素对人体细胞均无毒性作用。

除肽聚糖这一基本成份以外,革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌还各有其特殊结构的成分。

革兰氏阳性菌细胞壁特殊组份 细胞壁较厚,约20~80mm。肽聚糖含量丰富,有15~50层,每层厚度1nm,约占细胞壁干重的50~80%。此外尚有大量特殊组份磷壁酸(Teichoic acid)。磷壁酸是由核糖醇(Ribitol)或甘油(Glyocerol)残基经由磷酸二键互相连接而成的多聚物。磷壁酸分壁磷壁酸(Wall teichoic acid)和膜磷壁酸(Membrane teichoic acid)两种,前者和细胞壁中肽聚糖的N-乙酰胞壁酸连结,膜磷壁酸又称脂磷壁酸(Lipteichoic acid)和细胞膜连结,另一端均游离于细胞壁外。磷壁酸抗原性很强,是革兰氏阳性菌的重要表面抗原;在调节离子通过粘肽层中起作用;也可能与某些酶的活性有关;某些细菌的磷壁酸,能粘附在人类细胞表面,其作用类似菌毛,可能与致病性有关。此外,某些革兰氏阳性菌细胞壁表面还有一些特殊的表面蛋白,如A蛋白等,都与致病有关。

革兰氏阴性菌细胞壁特殊组份 细胞壁较薄,约10~15nm,有1~2层肽聚糖外,约占细胞壁干重的5~20%。结构比较复杂。尚有特殊组份外膜层位于细胞壁肽聚糖层的外侧,包括脂多糖、脂质双层、脂蛋白三部分。

          脂蛋白(Lipoprotein)一端以蛋白质部分共价键连接于肽聚糖的四肽侧链上另一端以脂质部分经共价键连接于外膜的磷酸上。其功能是稳定外膜并将之固定于肽聚糖层。

          脂质双层 是革兰阴性菌细胞壁的主要结构,除了转运营养物质外,还有屏障作用,能阻止多种物质透过,抵抗许多化学药物的作用,所以革兰氏阴性菌对溶菌酶、青霉素等比革兰氏阳性具有较大的抵抗力。一些化学物质如乙二胺四乙酸(EDTA)与2%十二烷基硫酸钠(SDS)或45%酚水溶液可以将外膜除去,而留下坚韧的肽聚糖层。此外,外膜蛋白质还可作为某些噬菌体和性菌毛的受体。

         脂多糖(Lipopolysacchride,LPS)由脂质双层向细胞外伸出,包括类脂A、核心多糖、特异性多糖三个组成部分,习惯上将脂多糖称为细菌内毒素。

        ①类脂A:为一种糖磷脂,是由焦磷酸键联结的氨基葡萄糖聚二糖链,其上结合有各种长链脂肪酸。它是脂多糖的毒性部分及主要成份。为革兰氏阴性菌的致病物质。无种属特异性,各种革兰氏阴性菌内毒性引起的毒性作用都大致相同。

         ②核心多糖:位于类脂A的外层,由已糖、瘐糖、2-酮基—3—脱氧辛酸(KDO)、磷酸乙醇胺等组成。经KDO与类质A共价联结。核心多糖具有属特异性,同一属细菌的核心多糖相同。

         ③特异性多糖:在脂多糖的最外层,是由数个至数十个低聚糖(3~5单糖)重复单位所构成的多糖链。革兰氏阴性菌的菌体抗原(O抗原)就是特异多糖。各种不同的革兰氏阴性菌的特异性多糖种类及排列顺序各不相同,从而决定了细菌抗的特异性。

         革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌的细胞壁结构显著不同,导致这两类细菌在染色性、抗原性、毒性、对某些药物的敏感性等方面的很大差异。

细胞壁的功能

         细菌细胞壁坚韧而富有弹性,保护细菌抵抗低渗环境,承受世界杯内的5~25个大气的渗透压,并使细菌在低渗的环境下细胞不易破裂;细胞壁对维持细菌的固有形态起重要作用;可充许水分及直径小于1nm的可溶性小分子自由通过,与物质交换有关;细胞壁上带有多种抗原决定簇,决定了细菌菌体的抗原性。

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